Селекция нового штамма винных дрожжей с высокой ферментативной активностью при минимальном синтезе SO2 , H2 S и ацетальдегидов

 Перевод Ирины Монастерецкой, ООО «Биомастер»

Несмотря на то, что сульфиты широко используются в виноделии, существует тенденция к минимизации и контролю их конечной концентрации. 

Помимо того, что сульфиты добавляют в сусла или вина, они также синтезируются винными дрожжами при спиртовом брожении, что может привести к задержке начала яблочно-молочного брожения (ЯМБ). Кроме того, сульфиты являются предшественниками солей сернистой кислоты, крайне нежелательного побочного продукта.

Несмотря на то, что винные дрожжи сильно отличаются по способности вырабатывать сернистые соединения, молекулярные механизмы таких различий пока известны мало.

Было проведено генетическое исследование для выявления молекулярных основ данных свойств. С помощью количественного генетического анализа, два сегмента генома, влияющие на производство SO2 и H2 S, были картографированы. Критический разбор количественных признаков локусов двух штаммов помог идентифицировать две аллели генов, ответственных за различия в производстве соединений серы.

Новый штамм был успешно селекционирован с помощью генетических маркеров, и это открывает новые возможности для дальнейшего совершенствования и адаптации винных дрожжей.

Вступление 

Спрос на новые винные дрожжи для улучшения специфических технологических качеств постоянно увеличивается, а новые познания в этой области способствуют развитию таких технологий. Клональная селекция, генная инженерия и эволюционная селекция  уже давно практикуются, но гибридизация более эффективный метод для таких усовершенствований. Штаммы не являются генно-модифицированными, так как генетических манипуляций не проводят, а дрожжи получают природные, но более эффективные и удобные в использовании.

Данный метод заключается в определении наличия взаимосвязи между одним или несколькими участками генома и фенотипической изменчивости в микроорганизмах. Как только такой участок был идентифицирован, появилась возможность передавать свойства с одного штамма дрожжей на другой, чтобы совместить ряд качеств, представляющих интерес.

В этом исследовании мы попытались определить область генома, ответственного за многочисленные энологические характеристики, в частности производство сульфитов. Несмотря на то, что сульфиты широко используются в виноделии благодаря своим свойствам (антимикробное и антиоксидантное), необходимость снижать и контролировать конечную концентрацию – основная тенденция в виноделии.

Высокие уровни содержания сульфитов в вине могут привести к отрицательному сенсорному воздействию, а также индуцировать задержку в ЯМБ.

Винные дрожжи способны производить от несколько мг/л сульфитов до более чем 90 мг/л, в зависимости от условий ферментации и штамма дрожжей. Несмотря на то, что сульфатный ассимиляционный путь уже широко изучен, о параметрах, влияющих на производство сульфитов, и молекулярных механизмах, ответственных за различия между штаммами дрожжей, известно мало.

Одним из наиболее активных SO2 -связывающих соединений является ацетальдегид. Его способность связываться с сульфитами определяет необходимость контролировать концентрацию диоксида серы в процессе виноделия и сильно влияет на стабильность вина после розлива. 

Цель данного исследования заключается в селекции новых энологических дрожжей, комбинируя несколько особенностей, представляющих интерес, таких как минимальный синтез SO2 /H2 S/ ацетальдегидов и высокие бродильные свойства. Оригинальный подход – это применение новых генетических методов и получение дрожжей без генетических модификаций.

Стратегия улучшения дрожжей с помощью метода молекулярных маркеров

Два комплементарных свойства винных дрожжей, представляющих интерес, были изучены в данной статье. Штамм JN10 самый надежный, имеет возможность завершить ферментацию в таких тяжелых условиях, как низкие или высокие температуры, очень осветленное сусло, а штамм JN17 характеризуется низким потреблением азота, сбалансированным профилем летучих соединений и производит небольшое количество SO2 , H2 S, ацетальдегида. 

В генетической карте локуса идентифицировали сегмент генома JN17, так называемый «ген интереса», ответственный за синтез низкого уровня SO2 и H2 S. Благодаря сочетанию фенотипических и генотипических данных, удалось выделить сегмент XIV хромосомы, который связан с производством сульфитов, и идентифицировать два гена метаболического пути серы: MET2 и SKP2. После этого появилась возможность целенаправленно передавать интересующие свойства от одного штамма к другому.

В нашем исследовании удалось передать такое свойство, как производство низкого уровня SO2 и H2 S от штамма JN17 в штамм JN10, с сохранением всех положительных энологических свойств JN10. Параллельно удалось передать две другие фенотипические особенности JN17 родительского штамма (низкое производство ацетальдегида и скромное потребление азота). 

Нашей целью было: 

• Передача «генов интереса» с штамма дрожжей JN17 в штамм дрожжей JN10 при помощи гибридизации. 

• Сохранение основной части генетического фона дрожжевого штамма JN10.

Селекция штамма дрожжей со свойствами обеих родительских штаммов

После успешной гибридизации штамм был подробно изучен в лаборатории в различных технологических условиях, чтобы подтвердить – положительные свойства штамма JN10 дрожжей сохранились, а способности, представляющие интерес, действительно передались от родительского штама JN17!

Эти дрожжи получили название Lalvin ICV oKay®. Исследование кинетики брожения и анализ вина подтверждают, что усовершенствованные дрожжи, полученные с помощью селекции, сохранили способности одного из родительских штаммов дрожжей (JN10), такие как активная и надежная ферментативная активность, а также отсутствие нежелательных продуктов брожения. 

Также для подтверждения надежности метода исследовали уровень производства SO2 , H2 S и ацетальдегидов в винах, ферментированных дрожжами Lalvin ICV oKay®. Действительно, этот штамм показал результаты, которые в разы превосходят возможности исходных дрожжей (Рис. 3). 

Экспериментальные испытания с дрожжами Lalvin ICV oKay® 

Опыты были проведены в INRA –экспериментальной установке PechRouge во Франции. Задачей было сравнить штамм Lalvin ICV oKay® с другими дрожжами. Ферментация проводилась на соках из трех различных сортов винограда: Мерло, Сира и Макабео. Дрожжи регидрировали с Go-Ferm PROTECT® и инокулировали при дозировке 25 г/Гл. 

При ферментации отслеживали кинетику брожения, а также уровень содержания SO2 , H2 S и ацетальдегида.

Бродильная активность дрожжей

В каждом конкретном случае новые дрожжи Lalvin ICV oKay® показывают результаты лучше, чем основные дрожжи: короткая лаг-фаза, высокая ферментативная активность без какого-либо риска остановки или замедления брожения. Измерения концентрации SO2 показали, что штамм oKay производит его на порядок меньше, чем любой другой штамм винных дрожжей. 

Понимание молекулярных основ фенотипического разнообразия винных дрожжей – это первый шаг на пути использования методов селекции для улучшения их технологических свойств. 

В этом исследовании мы смогли определить, что молекулярная основа отвечает за фенотипическую изменчивость в производстве сульфитов винными дрожжами. 

Исследования показали, что сочетание двух генов MET2 и SKP2, ответственных за фенотипические особенности, обнаружили среди двух родительских штаммов. Кроме того, было показано, что эти гены также обуславливают уровень синтеза SO2 , H2 S и ацетальдегидов.

До сих пор генетические исследования были сосредоточены на контроле выработанного H2 S, но предложенное решение (снижение редуктазной активности сульфитов) имело недостаток в
значительном увеличении синтеза SO2.

Впоследствии при помощи метода гибридизации множество других винных дрожжей может быть улучшено. Сегодня дрожжи Lalvin ICV oKay®, полученные с помощью этого метода, продемонстрировали удивительные качества и свою надежность. Все испытания, проводимые со штаммом Lalvin ICV oKay® по всему миру в течение последних двух лет, показали, что производство SO2 , H2 S и ацетальдегидов может быть практически нулевое, и в результате вина выражают полный ароматический потенциал, отвечая рыночным потребностям.